adenozintrifosfata Bioljuminesцenцija (Entrando)

síntesis no biológica de ATP en el medio extracelular se conoce [104], pero en general se acepta que tales fuentes son muy raros ATP [62].

ATP - una sustancia de alta energía se encuentra en todas las células vivas [104], y un componente esencial en las etapas iniciales del sustrato usando bioquímica, y también en la síntesis de material celular.

En el trabajo [84] fue mostrado por primera vez que la emisión de luz en un RkoyptrugaIe reacción bioluminiscente [luciérnaga (vuelo)] estimulada ATP. Método para la determinación de las concentraciones de ATP utilizando los extractos crudos de luciérnaga se describe en [84], y puesto que se utiliza en muchos campos como un método sensible y preciso de la medición de ATP. El catalizador para la reacción, seguido de emisión de luz, es la enzima luciferasa detectable en los escarabajos luminosos luciérnaga. Luciferase está implicado en la reacción siguiente:1.1

La reacción se acompaña de la emisión de luz, es eficaz; oxidación lyutseferina cada molécula está acompañada por la emisión de un fotón, y por lo tanto, se utiliza, cada molécula de ATP [112].

En el trabajo [78] descrito por primera vez el uso de la determinación cuantitativa de ATP por bioluminiscencia de luciérnaga para detectar la presencia de microorganismos viables. Después de la aparición del primer informe utilizando el método de bioluminiscencia, un gran volumen de trabajo por la definición de microorganismos viables en muestras ambientales [118]. Dado que todos los microorganismos viables contienen ATP, podemos asumir que el método de bioluminiscencia es bastante simple de usar para la rápida determinación del número de microorganismos. Los estudios han demostrado, sin embargo, que la cantidad de ATP en células microbianas de diversos diferente dependiendo de la etapa de especies, la nutrición, los efectos adversos y el crecimiento [118,119]. Por lo tanto, cuando se utiliza la bioluminiscencia es importante tener en cuenta lo siguiente:

  • tipo definido por el microorganismo (bacterias vegetativas comprenden usualmente 1 femtogrammu (fg) de ATP por célula [72], levadura contienen diez veces más [118], pero no contienen esporas de ATP [113]);
  • si las células negativas fueron expuestos a (por ejemplo, el agotamiento de nutrientes, de refrigeración o de pH cambiante); en tales casos, un corto de recuperación puede ser necesaria antes de la prueba;
  • Ya sea que las células están en un entorno en el que relativamente poco ATP (tal como un medio de crecimiento), o en una matriz compleja (como alimentos) con un contenido muy alto de fondo ATP.

Al probar las muestras de alimentos uno de los mayores retos - este es el último de los puntos anteriores. Todos los productos contienen ATP, y su contenido es típicamente mucho más alta que su contenido en microorganismos que se encuentran en estos productos. Data [113] muestran que la relación de productos en ATP bacterias ATP varía de Ltd. 40: 1 (helado) para 15: 1 (en la leche). Por lo tanto, para usar la definición de ATP como una prueba rápida para la detección de microorganismos en productos alimenticios, se han desarrollado métodos ramas microbiana ATP. Métodos Se estudiaron dos tipos: la separación física de microorganismos de otras fuentes y el uso de ATP agentes específicos para la retirada y destrucción de ATP no microbianas de extracción. técnicas de filtración se han utilizado con éxito para aislar microorganismos de las muestras de bebidas [77,79] y producción elaboración de la cerveza [65]. Estos métodos, sin embargo, es difícil de aplicar a las soluciones que contienen partículas, como filtros se obstruyen rápidamente. Una posible manera de resolver este problema se basa en el uso de doble circuito de filtrado [80], en el que el primer filtro elimina los residuos de alimentos, pero se salta los microorganismos, y el segundo filtro retiene los microorganismos antes del ensayo de lisis y bioluminiscencia. Otros investigadores [8,120] para separar selectivamente los restos de productos de microorganismos o resinas de intercambio iónico utilizados antes de ensayos bioluminiscentes.

Como resultado de la investigación cuidadosa extracción química selectiva fue demostrado con éxito la posibilidad de su aplicación para la separación microbiana y ATP leche no microbiana a [25] y carne [18]. Típicamente, en este método se utiliza la lisis de células somáticas (comida), seguido de la destrucción de la enzima ATP seleccionado (apirasa). A continuación, puede aplicar un agente de extracción más potente para la descomposición de las células microbianas, y luego - Test con luciferasa. Este método permite determinar solamente ATP microbiano.

Se produjo un número de dispositivos diseñados específicamente para la determinación de ATP microbiano. compañía Lumac (los Países Bajos), Foss Electric (Dinamarca), Bio Orbit (Finlandia) y Biotrace (UK) producen sistemas que utilizan métodos de separación, diseñados especialmente para la determinación de los microorganismos en los alimentos. Típicamente, estos sistemas funcionan bien y tienen características similares, incluyendo un umbral mínimo la determinación de bacterias 104 (células de levadura 103) y el análisis 1ch menos.

Además de determinar las muestras de alimentos en el número total de microorganismos viables, un número de informes sobre posibles aplicaciones ATP-bioluminiscencia en la industria alimentaria. Aplicación al ensayo de ATP en rápida saneamiento determinación considerado en [59] como un método para la evaluación rápida de la contaminación microbiológica, y como un método para medir la limpieza de la superficie total. Es el segundo caso de ATP-medición puede dar un resultado único. Como se mencionó anteriormente, casi todos los alimentos contienen grandes cantidades de ATP, así que usar un método bioluminiscente para realizar rápidamente las condiciones sanitarias de validación, residuos de alimentos en la línea de producción se pueden encontrar dentro de unos pocos minutos. ATP bioluminiscencia para supervisar la condición higiénica de superficies está actualmente ampliamente utilizado en la industria. Disponibilidad de Luminómetros relativamente barato, portátil y fácil de usar permite a muchos fabricantes de alimentos para introducir métodos de detección rápida sostyaniya higiénica, ideal para la vigilancia en el marco del sistema HACCP, en donde las condiciones higiénicas de la superficie - este es un punto crítico de control. Estos [51] indican que en todos los establecimientos encuestados empleen regularmente métodos monitoreo de higiene ATP, después de la introducción de estas técnicas mostró mejora de las condiciones sanitarias y de higiene. Tales sistemas de control basados ​​en la determinación de ATP se puede utilizar en la mayoría de las plantas de procesamiento de alimentos, las organizaciones de catering y en el comercio al por menor, y para evaluar las condiciones higiénicas de los vehículos (por ejemplo, tanque).

Una de las tareas que hasta la bioluminiscencia de ATP no pueden hacer frente, - la definición de microorganismos específicos. Es posible utilizar el medio de cultivo selectivo para microorganismos específicos cuando se cultivan antes del ensayo de sondeo ATP. Este enfoque, sin embargo, puede aumentar significativamente el análisis prodolzhtelnost en relación con lo que se puede esperar resultados erróneamente altos. factores lisogénicos Capacidad uso exitoso de votación liberación de ATP solamente a partir de células definidos, se muestra en el estudio descrito en [119]. Un conjunto de tales sustancias específicas más bien pequeño, por lo que el método puede tener aplicaciones limitadas. Quizás el método más prometedor desarrollado para la determinación de los organismos individuales es el uso de bacteriófago derivada por ingeniería genética [111,126,127].

Los bacteriófagos - son virus que infectan bacterias. El estudio de los bacteriófagos reveló que algunos de ellos son muy selectivos y infectan sólo ciertos tipos de bacterias. Por lo tanto, se puede introducir en la información genética bacteriófago, causando la producción de luciferasa bacteriana. Así, cuando un bacteriófago infecta cierta "maestro" bakteriyu-, y produce luciferasa comienza a producir luminiscencia. Este método requiere una cuidadosa elección del bacteriófago con el fin de evitar resultados falsos positivos o negativos, pero los estudios muestran que en el futuro los métodos basados ​​en la luminiscencia, se pueden utilizar para la determinación rápida de microorganismos específicos [124].

Se puede concluir que la utilización de ATP bioluminiscencia en la industria alimentaria ha desarrollado hasta el punto en que puede ser utilizado con seguridad para la determinación rápida de microorganismos viables (si un método efectivo utilizado para la separación de ATP microbiano). El potencial para el uso de este método en el análisis rápido de las condiciones higiénicas ahora se acepta generalmente. Los estudios también han demostrado que la luminiscencia hace posible la identificación rápida de microorganismos específicos, pero un sistema de este tipo antes de que se utiliza ampliamente en la industria de alimentos deben estar bien desarrollado.

técnicas de microscopía

Microscopía - un método reconocido y simple para la determinación del número de microorganismos. Una de las primeras descripciones de su uso se refiere a la rápida recuento de bacterias en las películas de la leche, teñido con azul de metileno [26]. Una de las principales ventajas de los métodos microscópicos - la velocidad a la que se pueden realizar los análisis individuales; pero debe tener en cuenta una gran cantidad de trabajo manual y la posibilidad de la fatiga del operador causada por conteo continuo.

El uso de colorantes fluorescentes en lugar de compuestos coloreados convencionales permite simplificar el cálculo, en relación con la que los colorantes han sido objeto de muchos estudios. Microbiólogos ambientalistas utilizan primero aquellos compuestos para hacer visibles los microorganismos en el agua natural, y contarlos [50, 67]. El uso de filtros de membrana de policarbonato de nuklepora (Nuclepore) para la separación de los microorganismos a la tinción fluorescente fue descrito por primera vez en el trabajo [58]. Contando discutido en detalle en [100], y desarrollado por el método de los autores es conocido como un método de filtro de epifluorescencia directa (técnica de filtro de epifluorescencia directa, DEFT).

método DEFT - un método manual laborioso, que dio impulso a la investigación en el campo de los métodos microscópicos de fluorescencia automatizado (preparación de la muestra automático y de alto rendimiento). El primer dispositivo totalmente automatizado basado en microscopía de fluorescencia, era Bactoscan (de la firma Foss eléctrico, Dinamarca), que fue desarrollado para el recuento de bacterias en la leche y la orina. Las muestras de leche se colocan en el dispositivo, están expuestos a tratamiento químico para la descomposición y disolución de las células somáticas micelas de caseína. Las bacterias se separan luego por centrifugación continua a dextrano gradiente / sacarosa. A continuación, los microorganismos se cultivaron con una proteasa para eliminar la proteína residual, después de lo cual se tiñeron con naranja de acridina y se aplican como una película fina en el disco giratorio bajo un microscopio. la radiación fluorescente de la imagen del microscopio se convierte en impulsos eléctricos y registrada. Bactoscan ampliamente utilizado para la inspección de la leche cruda en la Europa continental y ofrece una buena correlación de los resultados con los obtenidos por métodos tradicionales [71]. El método, sin embargo, tiene una baja sensibilidad (aproximadamente x células 5 104 por ml), lo que impide su uso para muestras con bajo número de bacterias.

Para herramienta de procesamiento de alimentos fue desarrollado método de recuento fluorescente, en el que las muestras se aplicaron sobre una cinta de plástico delgada. Dispositivo muestra Autotrak infligido a la cinta que pasa a través de las soluciones de tinción y lavado y luego se pasa delante de un microscopio de fluorescencia. Luz intermitente desde los microorganismos teñidas luego se cuenta por un fotomultiplicador. Análisis de muestras de alimentos mediante el uso de este instrumento mostró [13], que los residuos de alimentos muestras interfieren con la tinción y el recuento, y los resultados fueron significativamente más altos que los obtenidos mediante el recuento del número total de microorganismos viables.

Probablemente el mejor nuevo método de microscopía de fluorescencia, la industria de alimentos para el conteo rápido - es la citometría de flujo. La muestra teñida se pasa bajo un microscopio de fluorescencia como un líquido en la celda de flujo. impulsos de luz causada por la incidencia de la luz sobre las partículas de color se aplican a un fotomultiplicador y se contaron. Este método rápido automatizado es potencialmente muy flexible. De los métodos discutidos anteriormente microscopía es probablemente el más utilizado DEFT, y citometría de flujo es muy prometedor. A continuación vamos a ver con más detalle.

método DEFT

método DEFT fue desarrollado para contar rápida el número de bacterias en muestras de leche cruda [99,100]. El método se basa en el tratamiento previo de la muestra de leche en presencia de una enzima proteolítica, y tensioactivo a 50 ° C seguido por filtración de membrana, que separa los microorganismos. El tratamiento previo se utiliza para la expansión de las células somáticas y solubles en grasa, lo que podría bloquear el filtro de membrana. Después de membrana de filtración teñido con un colorante fluorescente de ácido nucleico de unión, naranja de acridina, después se lavó y se coloca en un portaobjetos de vidrio. La membrana se trata después a través de microscopio de epifluorescencia que ilumina la membrana con luz ultravioleta (el colorante emite luz visible que puede ser observada a través del microscopio). Puesto que el colorante se une a los ácidos nucleicos, se concentra en las células de los microorganismos, la unión a moléculas de RNA y DNA; Por lo tanto, cualquier microorganismo sobre la membrana puede ser visto y contado fácilmente. pretratamiento y el recuento completo se puede realizar por sólo 30 min.

Aunque el método DEFT permite el cálculo es muy rápido, que era muy lento, ya que todos los pre-procesamiento y cálculo se llevaron a cabo de forma manual y por lo tanto el rendimiento de este método ha sido muy pequeña. Desarrollo de métodos de recuento semi-automáticas basadas en el análisis de imágenes [99] posible superar algunos de los problemas de recuento manual, con lo que el método más cómodo para el usuario.

El trabajo sobre el uso de DEFT para el recuento de células en la leche cruda fue seguido por un análisis de otros tipos de productos. Pronto se descubrió que una buena correlación entre los resultados obtenidos número tradicionalmente DEFT y total de microorganismos viables en muestras de leche cruda que faltan en el análisis de la leche, la trata con calor [98]. Originalmente se cree que esto es debido a cambios en cocos Gram-positivo cuando tinción sensible a la temperatura [98], pero más tarde se demostró [3], de manera que se producen cambios en ambos microorganismos Gram-positivos y Gram-negativos. fenómenos similares se observaron también por tinción en el caso de tratamiento térmico de la levadura [106] y se irradiaron alimentos [14], y por lo tanto el uso como el método DEFT de la rápida determinación del número total de microorganismos viables se limita principalmente productos crudos.

Una lista de los tipos de producto para el que el método se puede utilizar DEFT Actualmente expandido. La literatura describe el uso de este método para carnes y verduras congeladas [108], la carne cruda [114], bebidas alcohólicas [33, 115], pasta de tomate [101], productos de confitería [96], alimentos deshidratados [92] y sanitaria control de la higiene [60]. También, algunos investigadores [107] escribió acerca de una posible modificación del método para la detección y enumeración de grupos específicos de microorganismos.

En conclusión, el DEFT- es un método muy rápido de calcular el número total de microorganismos viables en los productos crudos, aplicado con éxito en la industria. Sus desventajas incluyen la falta de selectividad y la incapacidad para dar una estimación precisa del número de microorganismos viables en los alimentos procesados. El primer problema puede ser resuelto por el uso de crecimiento selectivo de pasos cortos, o por marcación de los anticuerpos con fluorescente, pero estas soluciones requieren tiempo y dinero. El problema de los productos transformados sólo puede resolverse por los estudios de otros sistemas de colorantes de marcado células viables; en [15] ilustra este enfoque método fructífero y prometedor para la liberación y la introducción de tintes fluorescentes para microorganismos viables. Sin embargo, en la actualidad más intensidad de trabajo y baja productividad método DEFT limita su aplicación en la industria alimentaria.

Citometría de flujo

La citometría de flujo - un método basado en células de medición rápidos cuando pasan en el flujo de fluido más allá del punto [28] detección. La célula de ensayo se introduce en el centro del flujo de líquido (líquido portador). Esto hace que se pase por uno más allá del sensor y permite el registro de cada partícula, y no obtener los valores promedio para toda la población. En el punto de lectura tiene un haz de luz (UV o láser), dirigido a un flujo controlado, y uno o más detectores que miden la dispersión de la luz o fluorescencia de las partículas durante el paso bajo el haz de luz. Ampliar el uso de citometría de flujo en los laboratorios de investigación se debe principalmente al desarrollo de instrumentos fiables y numerosos sistemas de teñido. Los colorantes que se pueden utilizar con dispositivos para la citometría de flujo, permiten llevar a cabo una variedad de mediciones. sensores fluorescentes investigados se basan en la actividad enzimática, en el contenido de ácidos nucleicos, potencial de membrana y de pH; El uso de colorantes fluorescentes acopladas a anticuerpos unidos al sistema de elección.

La citometría de flujo se utilizó para estudiar un número de organismos eucariotas y procariotas. Trabajando con los eucariotas patógenos incluyen estudios ameba [89] y cultivo de levadura [64], y bacterias estudios incluyeron Escherichia crecimiento estudio coli [122], conde de cultivos de células bacterianas [103] y la determinación de las especies de Legionella en torres de refrigeración de agua [125].

Los métodos de citometría de flujo para la industria alimentaria están cubiertos en [130]. En el trabajo [41] investigado el uso de anticuerpos marcados con sustancia fluorescente, para la determinación de Listeria monocytogenes en la leche, y se han obtenido resultados alentadores. Se utiliza en este método de trabajo se basa en la cría selectiva de los organismos durante el día y, a continuación la tinción con anticuerpos polivalentes Listeria, marcado con fluoresceína izotiotsia- Nat. A continuación, las células teñidas se hizo pasar a través de un citómetro de flujo y se determinó L. monocytogenes. Se sugirió que este sistema podría ser utilizado con otros tipos de productos. Un enfoque similar también fue utilizado en [82] para la determinación de Salmonella typhimurium en los productos lácteos.

En [94] investigado el uso de un citómetro de flujo para contar Argus bacterias en cultivos puros y comida. Los resultados obtenidos con cultivos puros mostraron buena cálculo de correlación obtenido por un citómetro de flujo, con recuentos en placas a concentraciones 103 células por gramo, pero se obtuvieron resultados inconsistentes para la comida. La aplicación de este método para muestras de carne dio buen acuerdo con los cálculos en las placas y se dejó llevar a cabo las células recuento 105 por gramo. Resultados para la leche y pasta fueron peores, con la sensibilidad del sistema ascendió a pegar celdas 106 1 por ml, y las células inyectadas en la leche, no se detectaron en más de 107 a 1 ml. Baja sensibilidad del citómetro de flujo cuando las mediciones de los productos se ha atribuido a la influencia del sistema de conteo, causada por residuos de alimentos; autores han sugerido que este problema puede ser resuelto mediante la aplicación de los métodos de separación de células de microorganismos y residuos de alimentos.

Los métodos más exitosos de flujo aplicados citometría a productos alimenticios utilizando sistemas de detección de Chemunex ChemflowRjin levaduras en lácteos y de frutas productos [6] contaminantes. La técnica utilizada cuando se trabaja con este sistema, el producto requiere de incubación horas 16-20 seguido de centrifugación para separar y células concentrarse. A continuación se añade colorante, y la muestra se pasó a través de un citómetro de flujo para el análisis. Evaluación del Sistema [97] el ejemplo de refrescos, levadura fermentada, demostró que es fiable y fácil de operar. Estos citómetro en buen acuerdo con los datos de los métodos DEFT, sin embargo, el autor no ha datos del sistema que comparan los resultados con los resultados de los cálculos de las placas.

En estudios sistema Chemflow describe en [6], utilizando diferentes productos lácteos y de frutas, de levadura fermentada. Los resultados mostraron que la levadura se puede encontrar en los productos lácteos en un día en el que sólo hay células 1 25 en gramos. En los zumos de fruta era también recibió sensibilidad similar, pero para lograr que ya necesita un sistema de horas 48 ha demostrado su fiabilidad y facilidad de operación, y actualmente adaptado para la detección tanto de levadura y células bacterianas .; También hay opciones para el uso de la biomasa del fermentador y contando el total de la microflora en los vegetales. Chemflow El sistema se ha probado completamente bajo condiciones de producción en el análisis de los productos lácteos [43]. Los autores de este estudio indican una muy buena correspondencia con los resultados citómetro de recuento y en la placa (r = 0,98), y los resultados obtenidos a través de horas 24, lo que significa ahorros en los tres días en comparación con los métodos clásicos.

En conclusión, la citometría de flujo puede proporcionar un método rápido y sensible para el conteo rápido de microorganismos. El funcionamiento correcto del sistema depende del desarrollo y la aplicación de

a) respectivos sistemas y tinción

b) separar los procedimientos de microorganismos a partir de residuos de alimentos, que de otro modo interferir con el sistema de determinación. En el futuro, el citómetro de flujo equipado con un número de sistemas de fotodetectores podría permitir para analizar muestras al mismo tiempo de muchos parámetros, lo que simplifica en gran medida los regímenes de pruebas.

Citometría de fase sólida

Un relativamente nuevo citometría opción fue desarrollado por Chemunex (r. Meson-Alfort, Francia), basado en fase sólida citometría. En esta realización, la muestra pase a través del filtro de membrana, que retiene los microorganismos contaminantes. Entonces, para marcar las células metabólicamente activas de microorganismos para el filtro se aplica un colorante fluorescente. Después de la tinción, la membrana se transfiere a un dispositivo ChemScan RDI que explora toda la membrana con un láser contando las células fluorescentes. Realizar el procedimiento tarda aproximadamente 90 minutos y le permite definir las células individuales en la muestra en el filtro. Sistema para la fase sólida citometría ChemScan RDI- es una poderosa herramienta para el cálculo rápido de pequeñas cantidades de microorganismos. Es ideal para el análisis de agua u otros fluidos de percolación limpio, y el uso de métodos de marcado específicos se puede utilizar para detectar de manera selectiva ciertos microorganismos. Los productos alimenticios con partículas grandes pueden, sin embargo, interferir con el análisis, a fin de microorganismos antes de la filtración y el análisis deben ser separados del material alimenticio.

Los métodos inmunológicos. Los anticuerpos y antígenos

Los métodos inmunológicos se basan en reacciones de unión específicas, que fluye entre el anticuerpo y el antígeno apropiado. Anticuerpo - una moléculas de proteína que son producidos por los leucocitos en respuesta al contacto con una sustancia que causa una respuesta inmune. Campo de la anticuerpo está unido a una molécula conocida como un antígeno. Los antígenos utilizados en procedimientos inmunoquímicos, son de dos tipos: la primera se produce cuando el analito tiene un peso molecular bajo en sí por lo que no estimular una respuesta inmune - tales sustancias llamadas haptenos (antígenos defectuosos), y son para inducir una respuesta inmune y la producción de anticuerpos, en caso de está unida a una molécula más grande de un portador. El segundo tipo de antígeno es inmunogénico y puede por sí mismo provocar una respuesta inmune.

En los inmunoensayos dos tipos de anticuerpos se pueden usar: anticuerpos monoclonales y policlonales. Los anticuerpos policlonales se producen mediante el uso de para estimular la respuesta inmune de moléculas grandes (tales como proteínas o células bacterianas enteras). El gran número de sitios antigénicos que conducen a la formación de una pluralidad de diferentes anticuerpos en respuesta a la molécula o célula. Los anticuerpos monoclonales se producen utilizando cultivo de tejido de células de un leucocito; esto significa que se centran en un único sitio antigénico. la unión al antígeno es muy específica, y por lo tanto, métodos inmunológicos pueden utilizarse para detectar microorganismos o proteínas (por ejemplo, toxinas) específicos. En muchos casos, el uso de estos métodos, el anticuerpo se une una etiqueta cuando se une a ser fácilmente perceptible.

Etiquetas

Dado que los anticuerpos se pueden usar en muchos tipos de etiquetas, incluyendo radiomarcadores, sustancias fluorescentes, sustancias luminosas, y las enzimas; Además, para la detección de la unión del anticuerpo al antígeno puede ser utilizado reacción de aglutinación.

Los radioisótopos de uso común como etiquetas, principalmente debido a la alta sensibilidad que se puede lograr con ellos. Sin embargo, tienen algunos inconvenientes, el principal de los cuales es el peligro potencial de los reactivos. Esto impide su uso en cualquier lugar, excepto en laboratorios especiales, y por supuesto, la posibilidad de su uso en la industria alimentaria está en serias dudas.

Los marcadores fluorescentes se utilizan ampliamente para el estudio de los microorganismos. El agente más comúnmente utilizado - es fluoresceína, pero el uso de otra, por ejemplo, rodamina y umbeliferona. El caso más sencillo de utilizar anticuerpos fluorescentes - una microscopía. Los recientes avances en este campo - el uso de citometría de flujo para el análisis de preparaciones teñidas de flujo multiparamétrica y método de análisis de desarrollo inmunofluorescencia utilizando una enzima inmovilizada (ELIFA), algunas técnicas se han automatizado.

rótulos luminosos (fluorescente) se investigaron como una alternativa a potencialmente peligroso radiactivo [75]. Las etiquetas pueden ser o bien quimioluminiscente y bioluminiscente, y su ventaja en comparación con radiactivo y es fácil de usar ejecutable medición en un equipo simple a una sensibilidad similar [109]. Una serie de proyectos de investigación se han utilizado con éxito el análisis de quimioluminiscencia [81], pero la evidencia de su aplicación en la producción todavía.

Los anticuerpos utilizados para la determinación de antígenos en aglutinación y precipitación reacciones. Tales ensayos generalmente más difícil de realizar que otros inmunoensayo cuantitativo, y por lo tanto se utilizan para la evaluación cualitativa. Los análisis se llevaron a cabo de forma rápida y sencilla, que requiere un equipo mínimo de hardware.

Una serie de reacciones de precipitación se han aplicado con éxito en la industria alimentaria. Estos métodos se utilizan principalmente para confirmar la identidad de los microorganismos, pero no para determinar el conjunto de microorganismos. Tiempo de análisis utilizando estos métodos es relativamente pequeña, que son fáciles de usar y por lo general no requieren equipo especial, haciéndolos ideales para los laboratorios que realizan pruebas de rutina.

Disponible para varios conjuntos de muestras de aglutinación de látex para la Salmonella en alimentos. Entre ellos Kit Oxoid Salmonella Latex (Oxoid), diseñado para ser utilizado con el kit de prueba Oxoid kit de ensayo rápido Salmonella [61]; Kit micro pantalla Salmonella látex prueba de aglutinación de diapositiva (Mercia Diagnostics Ltd.); Kit de Prueba de color Wellcolex Salmonella (Wellcome Diagnostics) [53,54] y la prueba Spectate Salmonella (Rhone Poulenc Diagnostics Ltd.) [29]. En los dos últimos conjuntos se utilizan una mezcla de partículas de látex teñidas, que no sólo puede detectar, sino también identificar los serogrupos de Salmonella. Kits para muestras de aglutinación de látex también están disponibles para Campylobacter (Microscreen, Mercia Diagnostics), Staphylococcus aureus (Staphaurex, Wellcome Diagnostics), Shigella (Prueba de color Shigella Wellcolex, Wellcome Diagnostics) y Escherichia coli 0157: #7 {Oxoid). Agglyutina- muestras aislantes también están diseñados para la determinación de las toxinas microbianas, por ejemplo, una muestra de Oxoid enterotoxina estafilocócica inversa pasiva Látex Aglutinación de prueba [5,110].

inmunoensayo enzimático es ampliamente estudiado como un método para expresar las definiciones de los microorganismos de los alimentos. La ventaja de este ensayo es su especificidad alcanzado por el uso de anticuerpos específicos en relación con los puntos finales coloreados o fluorescentes que son fáciles de detectar visualmente o con un espectrofotómetro. La mayoría de los kits comercialmente disponibles utilizando inmunoensayo método "sandwich" de los anticuerpos a la primera captura y luego identificar células específicas o toxinas microbianas. Los kits vienen con dos tipos de anticuerpos conjugados: e inmovilizadas. El anticuerpo inmovilizado se une a un soporte sólido, por ejemplo, una célula de placa de microtitulación. muestra de alimento enriquecido se puede añadir a los antígenos de las células y presentes de cualquier célula determinada se unen a anticuerpos. La célula se lavó mediante la eliminación de residuos de alimentos y organismos no relacionados. Entonces, la célula puede ser añadido al anticuerpo conjugado con la enzima. Se unen a las células definidos, formando un "sandwich" de anticuerpos. Los anticuerpos no unidos se pueden lavar fuera de la célula y añadir el sustrato de la enzima. Cualquier presente enzima convierte un sustrato incoloro en un producto coloreado. Realizar inmunoensayo enzimático típico para la microplaca se tarda horas 2-3 y mostró la presencia de células bacterianas putativos. Los resultados de las muestras que muestran un resultado positivo siempre debe ser confirmado bioquímicamente y serológicamente.

Producido por un número de conjuntos de inmunoensayo enzimático, permitiendo determinar en muestras de alimentos de Listeria, Salmonella, Escherichia coli 0157, enterotoxinas estafilocócicas y toxina Bacillus diarreicas. La sensibilidad de estos sistemas es de unos 106 células / ml antes del análisis por lo que un procedimiento adecuado de enriquecimiento de la muestra se debe aplicar. Por lo tanto, los resultados pueden ser obtenidos a través período 2-3, en lugar de a través de 3-5, como en ensayos tradicionales.

En los últimos años, se ha desarrollado una serie de variantes del inmunoensayo automatizado, lo que hace que este método acelerado tiene menos tiempo. inmunoensayo enzimático de automatización se lleva a cabo de diferentes maneras - algunos fabricantes venden dispositivos que simplemente automatizan métodos estándar ELIS A (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas) a la microplaca. Estos dispositivos contienen el recipiente de reactivo y se utiliza pipeta robótica automático que realiza diversos reactivos necesarios en la secuencia correcta. La automatización del análisis se completa el lavado automático y la lectura, lo que reduce la complejidad de la misma. Hay por lo menos dos de fabricante que produce el sistema original con kits para ensayo inmunológico en un instrumento automatizado.

En el sistema de Vidas (bioMérieux, de Beyzingstok, Reino Unido), utilizando la tira de prueba contiene todos los reactivos necesarios para ELIS A. El primer pozo de la tira se inocula enriquecido muestra de alimento y se coloca en el aparato Vidas con la punta de pipeta, recubiertas en el interior anticuerpo inmovilizado. El instrumento se mueve entonces la punta de la pipeta a través de la muestra analizada en otras tiras celulares con diferentes reactivos necesarios para realizar el análisis. Todos los movimientos están completamente automatizados, así como para obtener los resultados finales de la prueba. El análisis por ELISA para el dispositivo Vidas puede realizarse por diversos microorganismos incluyendo Salmonella, Listeria, Listeria monocytogenes, E. coli 0157, Campylobacter y enterotoxina estafilocócica. Según los resultados de la comparación [20,22] se observó que los resultados del análisis automatizado, al menos equivalentes a los métodos de ensayo tradicionales.

sistema EIAFOSS (Foss Electiic, Dinamarca) es un sistema totalmente automatizado para el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas. En este sistema, todos los reactivos se transfieren automáticamente a tubos de ensayo con muestras, en las que se producen todas las reacciones. En EIAFOSS dispositivo implementado procedimiento original usando perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos como la fase sólida. Durante el análisis, estas perlas inmovilizadas con un imán instalado bajo el tubo de muestra. Kits para el análisis por instrumento EIAFOSS producido para Salmonella, Listeria, E. coli y Campylobacter 0157, con la investigación trabajan su buena podterdili [68].

La versión más reciente de la industria implementado en el inmunoensayo es tal vez el más simple. Inmunocromatografía opera con la sonda, que consiste en un relleno absorbente, que contiene partículas coloreadas recubiertas con anticuerpos específicos para el microorganismo. Las partículas están en el fondo de la sonda, y cuando se baja en el caldo de enriquecimiento microbiológico, se mueven hasta la carga (líquido se desplaza por acción capilar). En algún momento, la carga es un número de anticuerpos específicos inmovilizados. En presencia del microorganismo se produce define su unión con partículas de color. Este células conjugadas y partículas que se mueven hacia arriba la varilla por acción capilar hasta no cumplir con los anticuerpos inmovilizados, a la que está "pegan". partículas de color acumulados forman una línea de color claramente visible indica un resultado positivo de la prueba.

Este procedimiento se basa una serie de kits comerciales, incluyendo Oxoid Listeria Prueba Rápida [69] y Celsis Lumac Pathstik [70], lo que demuestra buenos resultados. métodos de inmunoensayo, así como otros métodos de inmunoensayo requieren de enriquecimiento, pero que no necesitan herramientas o equipos especiales, y requieren sólo unos pocos minutos después de que los contactos de la sonda con la muestra para ver el resultado positivo o negativo.

resumen de las conclusiones

Los métodos inmunológicos han sido ampliamente estudiado e implementado. Actualmente hay un número de sistemas que hacen posible la identificación rápida de microorganismos específicos para los que están destinados. Numerosas pruebas de desarrollo industrial de los dispositivos de análisis inmunológico demostraron que los resultados en gran medida corresponden bien recibidos por los métodos microbiológicos tradicionales. En particular, un inmunoensayo enzimático parece forma sencilla de reducir la duración del análisis en día 1-2. Automatización y miniaturización de los conjuntos de este tipo de análisis ha reducido el tiempo que tarda el operador para ejecutar la prueba, y simplificado significativamente el procedimiento realizado manualmente.

El principal problema de los sistemas de análisis inmunológicos - es su baja sensibilidad. El número mínimo de microorganismos inmunoensayo enzimático sistema necesaria para obtener un resultado positivo es aproximadamente 105 / ml. Si microbiólogo necesidad de determinar la presencia o ausencia de un microorganismo en 25 producto g de alimento siempre se requiere etapa de enriquecimiento, el uso de lo que aumenta la duración total del ensayo días 1-2.

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