La hibridación de ácidos nucleicos. ácidos nucleicos

Las características específicas de cualquier organismo dependen de la secuencia de ácido nucleico específica contenida en su genoma.

Los ácidos nucleicos que ellos mismos se componen de cadenas de bloques, cada uno de los cuales consta de un azúcar (ribosa o desoxirribosa, dependiendo de si el ácido nucleico es ADN o ARN), que contienen fósforo grupos y una de las cuatro bases purina o pirimidina orgánicos. DNA consta de dos de tales cadenas dispuestas en una doble hélice y bonos interconectados entre bases orgánicas. Motivos se unen selectivamente adenina con timina y guanina con citosina. Esto hace que los organismos únicos de secuencia de base.

Desarrollo de sondas (sondas) sobre la base de ácidos nucleicos

Sondas basadas en ácidos nucleicos - que son pequeños segmentos de cadena sencilla de ácidos nucleicos que se pueden utilizar para identificar secuencias genéticas específicas en muestras. Sondas (muestras) pueden diseñado para secuencias de ADN o de ARN. La atracción de la utilización de sondas de genes en la identificación de microorganismos es que la sonda que consiste en una secuencia de nucleótidos 20 es único y se puede usar para determinar con precisión el microorganismo [52].

Para detectar la unión de la sonda al ADN o ARN se define por el microorganismo, debe estar unido a una etiqueta que se detecta fácilmente. En primer lugar, el trabajo se llevó a cabo con marcadores de radioisótopos (por ejemplo, basado en fósforo radiactivo R32) que podría ser determinada por autorradiografía o recuento de centelleos. Uso y disposición de los isótopos radiactivos, sin embargo, inevitablemente asociadas a problemas de seguridad, que los hace inadecuados para las pruebas estándar en los laboratorios de producción de alimentos. Por lo tanto, para una amplia gama de sondas basadas en los ácidos nucleicos requieren otras etiquetas.

Una cantidad considerable de investigación se ha dedicado a la sonda marcada usando una comunicación "avidina-biotina." La base de esta técnica es la alta especificidad de la conexión entre la avidina y biotina. ácido nucleico sonda se marca con biotina e interactúa con un ADN detectable. Después se añadió avidina acoplada a una pantalla adecuada, por ejemplo, avidina-fosfatasa alcalina, y después de unión se detecta mediante la formación de un producto coloreado en el sustrato incoloro. El uso de tales sistemas de etiquetado nuevos mostró que las sondas con etiquetas no radiactivas se pueden usar para identificar microorganismos, pero son mucho menos sensibles que un sistema con un etiquetado radioisótopo y se requiere para la determinación del aumento del número de células (en comparación con el sistema de radioisótopo) viene a 100 veces .

Para crear un sondas no isotópicas con sensibilidad acercarse a la sensibilidad de las etiquetas de isótopos, era necesario explorar objetivos alternativos para las sondas en las células. Las sondas dirigidas a células de ADN unidas a unos pocos sitios en el cromosoma de las células del microorganismo opredelyamogo. Mediante el estudio de regiones de ácido nucleico celular que están presentes en un número relativamente grande de copias en cada célula, y la dirección de sondas para estas regiones puede aumentar significativamente la sensibilidad de las sondas no isotópicas. El trabajo en el aumento de la sensibilidad de las sondas se ha centrado en el uso de ARN como un objetivo. ARN - es un ácido nucleico monocatenario, que está presente en las células en diferentes formas. En una forma de que se encuentra en los ribosomas que son parte del sistema de síntesis de proteínas en la célula. Tal RNA (conocida como ribosomal RNA - rRNA) presente en las células en múltiples copias. La orientación de la sonda de ácidos nucleicos para el ARN ribosomal, puede aumentar significativamente la sensibilidad del sistema de análisis.

Las muestras para los microorganismos en los alimentos

procedimientos de hibridación de ácidos nucleicos para identificar bacterias patógenas en los alimentos se han descrito para las especies de Salmonella [35,47], Listeria [73,74], Yersinia enterocolitica [56,66], Listeria monocytogenes [38], de producción de enterotoxinas de Escherichia coli [55, 57], Vibrio vulnificus [87 ], de producción de enterotoxinas de Staphylococcus aureus [91], Clostridium perfringens y Clostridium botulinum [134].

El primer sistema analítico producido comercialmente para productos alimenticios fue presentado por Gene Trak Los sistemas basados ​​en la sonda de ácido nucleico (g Freminghem, Massachusetts, EE.UU.) en el año 1985 [47]. Se utiliza sondas de DNA selectivo para Salmonella y para determinar Salmonella en muestras de alimentos enriquecidos, se centró en el ADN cromosómico. El procedimiento de análisis consistía en ADN de hibridación determinado unido al filtro de membrana, y las sondas marcadas con fósforo-32. El tiempo total de análisis evolucionado a partir de 40-44 muestra h enriquecimiento en un procedimiento de medios no selectivos y selectivos y la posterior hibridación duró 4-5 horas. Así, el tiempo total de análisis fue de aproximadamente 2 días. Prueba de Salmonella en los Estados Unidos ha demostrado que es al menos equivalente al método estándar que utiliza la cultura [49]. empresa de ingeniería genética Trak creado sobre la base de este enfoque, el sistema de análisis de hibridación de especies de Listeria [73].

Kits sondas de genes de la compañía Trak fueron certificados en los Estados Unidos, y un número de laboratorios empezaron a usarlos. En Europa, sin embargo, en los laboratorios de producción de alimentos existe una reticencia a utilizar radioisótopos. Por otra parte, el fósforo-32 tiene una vida media corta, causando dificultades en el transporte de paquetes en áreas remotas. En el 1988, la empresa de Gene Trak importada desde sondas de etiquetado no isotópicos para Salmonella, Listeria y Escherichia coli, y el sistema de detección colorimétrica. Para superar la reducción en la sensibilidad causada por el uso de marcadores no isotópicos, el ácido nucleico diana en un ARN ribosomal celular era. El número de copias del ácido nucleico por célula estima en 500-20 LTD.

El ensayo de hibridación colorimétrico se basa en líquido de reacción de hibridación definido entre rRNA y dos oligonucleótidos separados utilizando sondas de ADN (sonda y el inmovilizado sonda-Signaling) específico para microorganismo definido. Inmovilizada molécula de sonda por enzimas complementado polímero que consiste en de alrededor de 100 residuos desoxiadenilato. Señalización molécula sonda está marcada químicamente con hapteno fluoresceína.

Después de la muestra de enriquecimiento de producto de ensayo correspondiente se transfiere a un tubo y microorganismos descomponen, liberando rRNA definido. Después se añadió inmovilizado y sondas de alarma hibridación se llevó a cabo. Si se determina rRNA está presente en la muestra, entonces no es la hibridación entre las sondas y determina rRNA. Una solución que contiene un complejo de "microorganismo sonda definidos", a continuación, pone en contacto con el sensor que contiene homopolímero de desoxitimidina unido (en las condiciones en que la hibridación es posible entre el polidezoksitimidinom polidezoksiadenozinom polímero y la sonda inmovilizada en el sensor). ácidos nucleicos no hibridados y los restos celulares después se aclararon, dejando el complejo de ADN-ARN inmovilizado unido a la superficie del sensor. interruptor de sonda unida fluoresceína antiflyuorestseinovogo determina añadiendo el anticuerpo conjugado con la enzima peroxidasa. La posterior adición de un sustrato cromogénico para la enzima da lugar a la coloración, que se puede medir mediante un espectrofotómetro.

Los resultados de ensayos colorimétricos [88] mostraron una buena concordancia entre la sonda y por métodos convencionales basados ​​en la cultura de Salmonella y Listeria. Resultó que la sensibilidad de los kits se encuentra entre los microorganismos ml 105 y 106 1 definidos, y por lo tanto es un importante procedimiento de etapa de enriquecimiento. Después de la introducción de los tres juegos de la compañía de Gene Trak comenzó a producir sistemas para Staphylococcus aureus, especies de Campylobacter y Yersinia enterocolitica.

Comercialmente sondas disponibles basados ​​en el ácido nucleico para confirmar la presencia de Campylobacter, Staphylococcus aureus y Listeria suministrada por la sonda Gen- (Gen sonda Inc., San Diego, EE.UU.). Estos kits se basan en la sonda del ADN monocatenario complementario al ARN ribosomal se define por el microorganismo. Después de que el ARN ribosómico aislado de un microorganismo, una sonda de ADN marcada conectada a la misma y forma un ADN complementario híbrido estable y ARN. La sonda hibridada se puede detectar a través de la luminiscencia.

Para el análisis se utiliza el método como el de protección de hibridación basado en el uso de éster de acridinio quimioluminiscente. Este éster se hace reaccionar con peróxido de hidrógeno en condiciones alcalinas, emisor de luz que puede medirse en un luminómetro. Los ésteres de acridinio unido covalentemente a sondas de ADN sintéticas a través de alquilamina de cadena. El ensayo se basa en la hidrólisis química diferencial del enlace éster. La hidrólisis de esta comunicación, están constantemente haciendo nehemilyuminestsentnym acridina. Cuando la sonda de ADN a la que se fija éter, se hibrida con ARN diana, acridina protegida de la hidrólisis y por lo tanto puede ser fluorescente. Los kits de ensayo se utilizan Campylobacter Listeria reactivo de varias sondas liofilizados. sonda Campylobacter reacciona con C. jejuni, C. coli y C. pylori; Listeria sonda reacciona con L. monocytogenes. En ambos casos, antes de usar la sonda para ensayos de confirmación debe ser un importante enriquecimiento de las culturas.

Las sondas del kit de evaluación para L. monocytogenes [21] ha demostrado que es absolutamente específico para el organismo diana. Para obtener un resultado positivo requiere la presencia de aproximadamente 106 L. monocytogenes. El kit aparece prueba rápida y fiable para confirmar la presencia y la cultura se puede utilizar directamente para el caldo de enriquecimiento, reduciendo así aún más la duración de la prueba.

sondas futuras

Desarrollo y uso de sondas en la industria alimentaria han avanzado lo suficiente en los últimos años. Producen componentes muestran su gran potencial, pero no se utiliza tan ampliamente como pruebas inmunológicas. Los microbiólogos siempre deben tener en cuenta la utilidad del análisis de la información genética de la célula. Tal vez, sin embargo, que los avances en biología molecular significa que la mejor manera de obtener esta información - es utilizar los métodos de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, reacción de polimerasa en cadena - CRP).

Los métodos de amplificación de ácido nucleico

varias técnicas de amplificación genética (técnicas de amplificación) se han desarrollado y mejorado en los últimos años. Estos métodos generalmente se basan en el ácido nucleico celular de amplificación bioquímica y pueden aumentar el número de copias por 2-3 h 107 tiempo. Muy rápido aumento en el número de objetivos consigue utilizando técnicas de amplificación de ácido nucleico, lo que es ideal para el desarrollo de la detección rápida de los sistemas microbianos. Actualmente, un número de métodos de amplificación utilizado para la detección de microorganismos:

  • reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y sus variantes, incluyendo PCR anidada, PCR con transcriptasa inversa (dependiente de ARN polimerasa de ADN) y PCR múltiple;
  • репликаза Q-бета;
  • reacción de amplificación de la ligasa (LAR) \
  • amplificación transcripción (TAS), también conocido como auto replicación sostenida de secuencia (3SR) o secuencias de ácido nucleico basados ​​en la amplificación (NASBA, Nucleic Acid basada en la secuencia de amplificación).

De estos métodos de amplificación solamente CRP se introdujo en la industria en la forma de un procedimiento basado en el conjunto para la determinación de los microorganismos de los alimentos. Utilizando NASBA llevó a cabo diversos estudios, una serie de documentos que describen el uso de este método para la determinación de patógenos transmitidos por los alimentos, pero todavía en el mercado no hay kits disponibles comercialmente.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

PCR - un método utilizado para repetible en la síntesis enzimática in vitro de secuencias de ADN específicas, utilizando dos cebador de oligonucleótido corto Estos cebadores se hibridan a cadenas opuestas de la molécula de ADN y son adyacentes a la región de interés del ADN diana. PCR procede a través de una serie de ciclos secundarios que comprenden la desnaturalización de ADN, hibridación del cebador y aumentar los cebadores por la ADN polimerasa. Estas tres etapas de cada ciclo se controla cambiando la temperatura de reacción, ya que cada paso se produce sólo a ciertas temperaturas. Estos cambios de temperatura se llevan a cabo utilizando un dispositivo especial de ciclos térmicos. Productos cebadores aumentan después de un ciclo sirven como plantillas para el próximo ciclo, y por lo tanto el número de copias de la diana de ADN se duplica en cada ciclo.

Chain Reaction "polimerasa-transcriptasa inversa" (TSROT-P)

Esta reacción implica el uso de PCR para el ARN diana. PCR tiene que trabajar en la molécula de ADN, y por lo que inicialmente la transcriptasa inversa se utiliza para obtener una copia del ADN, después de lo cual se utiliza la copia en PCR convencional. Reacción en cadena "polimerasa-transcriptasa inversa" (TSROT-P) está particularmente bien adaptado para ciertas pruebas microbiológicas. Algunos virus alimenticios contienen ARN como material genético. Por lo tanto, si la amplificación necesaria y, en consecuencia, la definición de virus, se debe utilizar TSROT-P. La segunda aplicación TSROT-P - la definición de microorganismos viables. Uno de los problemas asociados con la PCR - su alta sensibilidad y capacidad de aumentar las concentraciones muy bajas de ácido nucleico determinado. Por lo tanto, cuando se usa PCR para determinar la presencia o ausencia de un microorganismo particular en el producto alimenticio, esta reacción puede determinar el microorganismo incluso en el caso si fue previamente hizo inactivo debido al proceso correspondiente. Esto puede conducir a un resultado positivo falso. Para superar este problema, puede utilizar TSROT-P dirigida a las células de ARN mensajero, que sólo las células activas y después de la formación tiene una vida media corta. Por lo tanto, la determinación de ARN mensajero específico (infRNK) a través de TSROT-P indica la presencia de microorganismos viables.

NASBA

NASBA - este procedimiento de amplificación múltiple multienzimático requiere un gran número de enzimas y reactivos que la CRP estándar. Su ventaja es que es un procedimiento isotérmico, y por lo tanto todos los pasos de la reacción se produce a una temperatura única, haciendo innecesario que el dispositivo de termociclado. Se publicó una serie de documentos sobre el uso de NASBA para determinar patógenos transmitidos por los alimentos (ver., Por ejemplo, [128]), pero este procedimiento todavía no es ampliamente utilizado.

componentes industriales sobre la base de la PCR

Actualmente los kits basados ​​en la PCR para la detección de microorganismos en los productos alimenticios fabricados por tres compañías. Incluido VAC (firma Qualicon, EE.UU.) se utilizan reactivos en tabletas dispositivo de ciclado térmico tradicional y método basado en electroforesis en gel. Las muestras con reacción positiva pueden ser vistos como una banda en un gel de electroforesis. CVC produce kits para Salmonella [9], género Listeria Listeria monocytogenes, y E. coli 0157: YA7. Los ensayos para la Salmonella y E. coli 0157: #7 ensayaron de la Asociación de Investigación Científica Instituto de Químicos Analíticos (AOACRI) y han certificado ellos.

El segundo grupo de kits de PCR disponibles en el mercado - un conjunto Probelia (compañía Sanofi, Francia), que utiliza PCR convencional seguida de sistema de inmunoensayo y la determinación colorimétrica de Salmonella y Listeria.

Última producida por el sistema de PCR - un sistema TaqMan (Perkin-Elmer firme, EE.UU.). Se utiliza el nuevo sistema de sonda que comprende una etiqueta de TaqMan etiquetarlo no fluoresce en la forma original, pero después de la sonda está conectado entre los cebadores de PCR, se puede actuar sobre el enzima ADN polimerasa utilizada en la PCR para formar un producto final fluorescente. Esta fluorescencia se determina usando un sistema de detección especial. Disponible en kits para TaqMan Salmonella, Listeria y conjuntos de E. coli 0157 diseñada. Una de las más interesantes posibilidades para el uso de TaqMan - es la cuantificación. Actualmente, todos los sistemas basados ​​en PDO se utilizan para determinar la presencia o ausencia de microorganismos, y los métodos y dispositivos TaqMan puede proporcionar información sobre el número real de microorganismos, es decir, la PCR se usa para el recuento rápido.

Aislamiento de microorganismos a partir de los productos alimenticios y su concentración

En los últimos años ha habido un considerable interés en el potencial de aislar microorganismos de los alimentos y posterior concentración de ellos para obtener un mayor número por unidad de volumen. Este interés es el hecho de que muchos métodos existentes para las pruebas rápidas tienen una sensibilidad limitada - por ejemplo, 104/ Ml para luminiscencia ATP, 106/ Ml - para medidas eléctricas, 105-106/ Ml - para la sonda de inmunoensayo y el ADN, sobre 103/ Ml - para los kits existentes basados ​​en PCR. Estos niveles de sensibilidad significa que por lo general se requiere que el periodo de crecimiento antes de la división determinada ekpress-, puede aumentar significativamente el tiempo de análisis total.

Una manera de resolver este problema asociado con la separación y concentración de microorganismos a partir de los productos alimenticios para ser capaz de detectar organismos en una concentración superior. Una ventaja adicional es que las células microbianas pueden separarse de la matriz alimentaria, lo que en algunos casos puede contener materiales que interfieren con la determinación. Un ejemplo sencillo de concentración - Este análisis líquidos puros (agua, refrescos transparentes, vinos, cervezas, etc ...) en el que los niveles de contaminación son por lo general muy baja. Por lo tanto, para la concentración de microorganismos en un área pequeña de sus grandes volúmenes sometió a filtración de membrana. microorganismos detenidos pueden ser analizados. El análisis detallado de los métodos de concentración se da en [11]. Hay cinco categorías de técnicas: filtración, centrifugación, separación de fases, electroforesis y métodos inmunológicos.

De estas categorías de la etapa de producción industrial sólo alcanzó métodos inmunológicos para el uso en el análisis de alimentos sólidos. separación inmunomagnética se basa en el revestimiento de pequeñas partículas magnéticas con anticuerpos específicos para una célula particular. Las partículas recubiertas se pueden añadir a la suspensión de alimento o medio de cultivo en el caso de que se definen por la presencia de células unidas a los anticuerpos en las partículas.

Aplicación de un campo magnético mantiene las partículas con las células unidas a ellas, lo que permite el drenaje el exceso de residuos líquidos y alimentos y de ese modo separar las células de la matriz del alimento y concentrarlos. Tal sistema es producida por empresas Dynal (Noruega), LABM (Reino Unido) y Denka (Japón), y un sistema automatizado basado en un procedimiento de este tipo produce Foss Electric (EIAFOSS). Los kits para la Salmonella, Listeria, E. coli 0157, otros verotsitotoksin producción de E. coli y Campylobacter producen diferentes empresas. Los sistemas que implementan técnicas de separación inmunomagnéticas para determinar la presencia de E. coli 0157, ampliamente utilizados, y en muchos países, estas técnicas se han convertido en estándar.

Detección e identificación de las características de microorganismos

Después de la separación de los microorganismos del producto alimenticio a veces es necesario establecer qué es exactamente este microorganismo. Esto es especialmente importante si se asume que este patógeno. Tradicionalmente utilizado en los métodos para la identificación de ensayos bioquímicos o inmunológicos y microorganismos purificados. El progreso en la biología molecular ha hecho posible la identificación de microorganismos en la estructura de su ADN. La sensibilidad de los métodos basados ​​en ADN realidad hace que sea posible identificar a un nivel inferior al de la especie (normalmente este procedimiento se llama caracterización o subtipificación). Subtipificación - es una nueva y poderosa herramienta utilizada por los microbiólogos no sólo para referirse a los microorganismos, sino también para determinar su origen. Por lo tanto, podemos identificar en algunos casos, el microorganismo en el producto acabado, y luego con la ayuda de una serie estructurada de pruebas para encontrar si su fuente ciertas materias primas, el entorno en el área de producción o piezas mal lavadas de equipo.

Un número de ensayos basados ​​en ADN, que permiten la subtipificación (muchos de los cuales se discuten en [17]), sin embargo, sólo un método ha sido totalmente automatizada y ahora está disponible para el Laboratorio de Microbiología de las empresas de alimentos. Este dispositivo ribotipaje través Qualicon RiboPrinter (firma Qualicon, EE.UU.). En el instrumento totalmente automatizado sirve colonias bacterianas aisladas purificadas dan rangos de muestras de ADN (RiboPrint-estructura), que se comparan automáticamente con una base de datos para la identificación y caracterización. El método se aplicó con éxito en la industria alimentaria para la determinación de impurezas, y para identificar las fuentes de caminos de contaminación, así como la comprobación de los cultivos de autenticidad [12].

El futuro de los métodos microbiológicos

métodos microbiológicos tradicionales en las últimas décadas no se cambiaron mucho. Para el recuento, la detección e identificación de microorganismos en muestras microbiólogos básicamente siguen utilizando el enriquecimiento a largo plazo y métodos basados ​​en el crecimiento de microorganismos en agar. Con el desarrollo de la tecnología de la producción de alimentos está en constante crecimiento necesidad de más rápida recepción de los datos microbiológicos.

Acelerado desarrollo del mercado de los productos y la producción de productos refrigerados con una vida útil relativamente corta dado lugar a la creación de métodos automatizados acelerados y sistemas para su aplicación. Su uso hace posible: a) las materias primas probados antes de su uso; b) el control de las condiciones higiénicas de las líneas de producción, en tiempo real, y c) las pruebas de productos terminados en un tiempo más corto. Todo esto debe conducir a la creación de productos más alta calidad de larga conservación.

Todo lo discutido en este capítulo, los métodos actualmente utilizados en los laboratorios de producción de alimentos. Algunos métodos (por ejemplo, el poder) se diseñan, implementan y utilizan desde hace mucho tiempo, mientras que otros (por ejemplo, PCR) se han desarrollado mucho más tarde. Todos estos métodos tienen buenas perspectivas, tomadas como un estándar y no son totalmente nuevos. Algunos fabricantes de alimentos están empezando a darse cuenta de los beneficios de combinar una variedad de métodos rápidos para obtener resultados aún más rápidos. Un ejemplo es el uso de inmunoensayo enzimático para la detección de la presencia de Listeria subespecies con el uso subsiguiente de sondas de ácido nucleico (especie microbiana específica) para confirmar la presencia o ausencia de L. monocytogenes.

Uno de los problemas con algunos métodos rápidos es su falta de sensibilidad. En muchos casos, esto significa que se necesita mucho enriquecimiento antes de usarlos. Los métodos de investigación para separar y concentrar los microorganismos de muestras de alimentos permitiría separar los microorganismos de residuos de alimentos y para concentrarlos, eliminando la necesidad de procedimiento que consume tiempo de incubación. Desarrollos en el campo de los métodos de ADN para la detección e identificación / caracterización de la ventaja a la creación de nuevas herramientas para la producción microbiólogos alimentos. No hay duda de que en el futuro van a dar este tipo de posibilidades para el análisis, lo que hoy es difícil de imaginar.

Literatura para toda la sección » Métodos tradicionales y acelerados de análisis microbiológico ".

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