Los métodos tradicionales y acelerada de análisis microbiológico

Р. П. Бете, Campden y Chorleywood Food Research Association

introducción

Detección e identificación de microorganismos en los alimentos o sobre las superficies que entran en contacto con ella, es una parte integral de cualquier control de calidad y sistema de evaluación. Microbiológicos Pruebas de comida se puede dividir en dos tipos: a) cuantitativo en el que se cuentan grupos de microorganismos en la muestra y los resultados se expresaron como la cantidad de organismos presentes por unidad de masa de la muestra, y b) cualitativo ( "presencia / ausencia"), que se reducen a detectar la presencia o ausencia de un microorganismo particular a una muestra de cierto peso.

La base de los métodos utilizados para la detección de microorganismos en productos alimenticios es bien conocido y se basa en la introducción de producto alimenticio en el medio de cultivo en el que los microorganismos se pueden reproducir, que aparentemente conduce al crecimiento. Dichas técnicas son sencillas, flexibles, baratos y suelen ser adecuados, pero tienen dos inconvenientes: en primer lugar, las pruebas basadas en el crecimiento de los microorganismos en el medio ambiente, lo que puede llevar mucho tiempo y conduce a una prueba de larga duración; en segundo lugar, los métodos centrados en su rendimiento y, por lo tanto mano de obra intensiva.

En los últimos años, una gran cantidad de investigación en el campo de las técnicas microbiológicas automatizados acelerados (análisis rápido). El objetivo de estos estudios era reducir la duración de la prueba (mediante la aplicación de otros métodos que el crecimiento de microorganismos para la detección y / o contar los microorganismos) y en la reducción de la complejidad (por máxima automatización posible). Los métodos rápidos automatizados han recibido algún tipo de reconocimiento en la industria alimentaria y podrían formar una herramienta importante de productos refrigerados de control de calidad. resultados de los análisis rápidos pueden aumentar la vida útil de los alimentos refrigerados en uno o dos días, en comparación con el método microbiológico tradicional. Además, la presencia de los métodos acelerados de análisis rápido microbiológica indica la presencia de capacidades de gestión en tiempo real, y su uso en el sistema de evaluación de la calidad de acuerdo con el método superred de Estados Unidos.

muestreo

Aunque este capítulo se centra en los métodos utilizados para el ensayo de productos alimenticios para microbiología particularmente importante cuestión del muestreo. No importa lo bueno que un método particular, si la muestra tomada está mal y no es representativa del lote del que se toma, los resultados de las pruebas no tienen sentido. Es útil para desarrollar un plan de muestreo en el que los resultados se determinan sobre la base de una serie de pruebas, en lugar de un resultado. Actualmente, los microbiólogos utilizan comúnmente planes de muestreo con dos o tres conjuntos de muestras, que indican el número de muestras de ensayo individuales del mismo lote (junto con los límites microbiológicos actuales). Estos planes de muestreo se describen en detalle en la obra [2].

Una vez plan de muestreo desarrollado, una parte representativa del producto debe ser tomada para el análisis. Con este fin, el microbiólogo debe entender con cierto detalle en el producto y su microbiología. Muchos de los productos refrigerados no son mezclas homogéneas, y se componen de capas o porciones de (un buen ejemplo es el sándwich listo). Es necesario decidir si los resultados microbiológicos necesarios para un sándwich (es decir, pan y coberturas), sólo el pan o sólo para el relleno. De hecho, en algunos casos puede ser necesario para comprobar una de la carga mixta. Tras la decisión de analizar una muestra por un método apropiado de medios de muestreo asépticas y estériles se puede tomar [76]. Tras el desarrollo de procedimientos de muestreo microbiólogo puede estar seguro de que las muestras tomadas son muestras representativas del producto objeto de los métodos de prueba y de ensayo pueden ser de confianza.

métodos microbiológicos tradicionales

Como se indica en la introducción de esta sección, técnicas microbiológicas tradicionales se basan en el método universalmente aceptado: una muestra del producto alimenticio se coloca en un medio de y durante algún tiempo se mantuvo allí durante el crecimiento microbiano. Determinación de microorganismos o su recuento se lleva a cabo a continuación mediante evaluación visual normal de crecimiento del cultivo. Estos métodos son técnicamente simple y relativamente barato, ya que no requiere equipos sofisticados. Por lo tanto pueden ser fácilmente adaptados para determinar el número de diferentes grupos de microorganismos.

Antes de la prueba, las muestras de alimentos deben ser convertidos a forma líquida, de modo que puedan ser mezclados con el medio para el cultivo. Esto se hace generalmente como sigue: una muestra se pesa con precisión en un recipiente estéril y se añade por un volumen conocido de un disolvente estéril (la relación de la muestra al disolvente es generalmente 1: 10); después la mezcla resultante se homogeneizó con un homogeneizador que aplasta la muestra, y en el que todos los microorganismos entran en solución. Es importante la elección adecuada de disolvente - si microorganismos negativos en una muestra se eligen correctamente valor de pH o baja presión osmótica, que pueden ser dañados o muertos, lo que afectará el resultado final de la prueba microbiológica. El disolvente debe estar bien tamponado a pH, los productos de prueba respectivas, y para ser osmóticamente equilibrada. En las pruebas de algunos productos (por ejemplo, se secan) que puede contener microorganismos están fuertemente afectados adversamente antes de comenzar la prueba, puede requerir un cierto período de recuperarlos, por lo que las células no mueren en su fase inicial [39].

métodos cuantitativos tradicionales

Contando el número de microorganismos en las muestras se hace generalmente por contar con una placa o por el número más probable (NMP). El que más se utilizó por primera vez uno de estos métodos, y la segunda por lo general se usa sólo para ciertos microorganismos (por ejemplo, Escherichia coli) o grupos (por ejemplo, coliformes).

Método de cálculo en la placa

contando método en una placa basada en la premisa de la muestra en una capa de agar en una placa de Petri o en él. Los organismos individuales o grupos pequeños ocupan su asiento separado en el agar, y después de la incubación crecen para formar colonias individuales, el número de los cuales se contaron visualmente. Para contar el número de diferentes tipos de microorganismos se pueden utilizar varios tipos de medio de agar. El uso de medio de crecimiento no selectivo que se mantiene a 30 ° C en condiciones aerobias, dará la puntuación total de microorganismos viables, o recuento aeróbico mesófila. Al cambiar las condiciones de incubación en la anaeróbico, anaeróbico obtiene la puntuación total. Los cambios de temperatura provocan cambios en los tipos de microorganismos capaces de crecer, que muestra una cierta flexibilidad con el enfoque tradicional de usar agar. Si hay un requisito para determinar el número de microorganismos en una muestra de un cierto tipo, para permitir el crecimiento de sólo el tipo deseado de microorganismos, en la mayoría de los casos es necesario cambiar la composición del medio. Hay tres enfoques para la creación de ambientes que crean un ambiente especial: tratamiento de elección, selectivo y diferencial.

Los procedimientos electivos - son aquellos en los que los reactivos comprenden un medio o condiciones de crecimiento de uso, que contribuye al desarrollo de microorganismos definidos, pero no inhiben el crecimiento de otros. Tales reactivos pueden servir como azúcares, aminoácidos u otros factores de crecimiento. Por procedimientos selectivos incluyen reactivos que incorporan procedimientos o el uso de condiciones de crecimiento que inhiben el crecimiento de microorganismos distintos de los definidos. Cabe señalar que en muchos casos, factores selectivos también afectarán negativamente el crecimiento de microorganismos definidos, pero este impacto será menor que su impacto en otras células. procedimientos ejemplares son introducción selectiva a los antibióticos uso de entorno o condiciones de crecimiento anaerobias. Finalmente procedimientos diferenciales permiten distinguir entre organismos de las reacciones que causan sus colonias en el medio. Un ejemplo es la introducción del indicador en el medio de pH, para distinguir los microorganismos ácido formando. En la mayoría de los casos, el medio usará un sistema con un enfoque integrado que comprende componentes electiva, selectivos y diferenciales, de manera que el usuario puede identificar y contar el microorganismo definido.

El número de los tipos actualmente disponibles de agar es demasiado alto, incluso para simplemente lista ellos. Sus características se encuentran en las firmas manuales de referencia que producen estos entornos (por ejemplo, Oxoid, LABM, Difco, Merck).

método NMP

El segundo de los procedimientos de recuento mencionados anteriormente - un método MPN, que permite estimar el número de microorganismos viables en una muestra basada en un método estadístico. Estimación se obtiene mediante la preparación de la dilución de diez veces de la muestra y la transferencia de cada uno recibió tres diluciones (por lo general) los tubos de medio de nutrientes. Los tubos se mantuvieron, y aquellos en los que no hay ningún crecimiento (turbidez), se fijaron y se comparan con una tabla estándar de los resultados [2], en el que el nivel específico de contaminación del producto.

Este método se utiliza sólo para ciertos tipos de pruebas, ya que es más lento, y requiere más material que en el método de recuento en placa. Además, el límite del intervalo de confianza son grandes, y por lo tanto, este método es generalmente menos preciso que el método de recuento en la placa.

métodos cualitativos tradicionales

se utilizan procedimientos cualitativos cuando no se requiere un número conocido de microorganismos en la muestra, pero se requiere sólo para descubrir que están presentes o ausentes. Típicamente, se utilizan tales métodos para identificar organismos potencialmente patógenos tales como Salmonella, Listeria, Yersinia y Campylobacter. Para realizar el análisis a ser homogeneizados muestra pesada con precisión (típicamente 25 g) en caldo nutriente primario y se incuba durante un tiempo predeterminado a una temperatura predeterminada. En algunos casos, la muestra después de que el caldo primario puede requerir la transferencia a un caldo nutriente secundaria y exposición adicional (incubación). El producto resultante se aplica en general a una placa de agar selectivo, en el que determina el posible crecimiento del microorganismo. procedimiento el cultivo continuo se usa porque la muestra puede contener muy pocos microorganismos e identificado un gran número de "fondo". Además, los alimentos procesados ​​pueden ser determinadas por los microorganismos en un estado dañado, y por lo tanto los métodos de cultivo permiten la recuperación de las células dañadas y su cultivo selectivo posterior en presencia de un gran número de microorganismos de la competencia.

microorganismo seleccionado en el caldo de cultivo es normalmente imperceptible, por lo que el caldo se debe aplicar a la placa de agar selectivo / diferencial. A continuación, los microorganismos pueden ser detectados por la aparición de colonias. Educación típicas colonias microbianas opredelemyh sobre agar se describe como colonias putativas. Para confirmar que estas colonias se componen de microorganismos definidos, por lo general llevado a cabo la determinación bioquímica y serológica adicional sobre cultivos puros de microorganismos. Esto normalmente requiere que la colonia para asegurar la pureza de un aislamiento primario placas fueron pospuestas de nuevo. Las colonias purificadas fueron entonces comprobarse bioquímicamente mediante el cultivo en un medio que indica si el microorganismo produce enzimas específicas o si específica utiliza el azúcar.

En la actualidad, un número de compañías que venden el sistema en miniatura para las pruebas bioquímicas, permiten microbiólogos para realizar rápida y fácilmente definición expresa bioquímica o pruebas automatizadas. Las pruebas serológicas se realizan en cultivos puros de ciertos microorganismos seleccionados (por ejemplo, Salmonella) utilizando antisueros comercialmente disponibles.

métodos Express y los métodos automatizados

interés general en los nuevos métodos microbiológicos determinados en parte por el aumento del volumen de la producción de alimentos. Esto conduce a:

  • aumentar el volumen de las muestras almacenadas para producir un resultado positivo (reducción del tiempo de análisis que reduciría los costes de almacenamiento);
  • aumentar el número de muestras analizadas en el laboratorio (la única posibilidad de procesamiento - es aumentar el tamaño de su personal y laboratorios, así como el uso de métodos automatizados más aceleradas);
  • productos refrigerados de vida útil más larga (la reducción del tiempo de análisis podría acelerar la producción y con ello aumentar la vida útil);
  • aumentar el uso de procedimientos de HACCP (métodos rápidos se pueden utilizar en los procedimientos de control de calidad para el método HACCP).

Hay varios métodos, que son llamados "métodos rápidos", y la mayoría de ellos son muy diferentes entre sí y de los procedimientos tradicionales, que reemplazan. Estos métodos se pueden dividir en los ensayos cualitativos y cuantitativos, donde el primer valor dado del número de microorganismos en la muestra, mientras que el segundo sólo indican su presencia o ausencia. En los laboratorios, que examina la cuestión de la utilización de métodos rápidos para las pruebas estándar (de rutina) deben definir cuidadosamente sus necesidades antes de comprar uno u otro sistema de análisis rápido. Cada nuevo método es único y da un resultado ligeramente diferente de los demás, tenía un cierto tiempo, nivel de automatización y productividad. Además, algunos métodos no funcionan bien con ciertos tipos de productos o pueden no detectar ciertos microorganismos o grupos que desee definir. Todos estos factores deben ser considerados antes de tomar una decisión sobre la inclusión de un método en particular en el arsenal de laboratorio. También es importante que el personal están utilizando nuevas técnicas para comprender los principios que subyacen en ellas, y por lo tanto, cuando los resultados obviamente equivocadas podrían descubrir la causa de su recepción.

métodos eléctricos

La cuantificación de microorganismos en una solución con dos métodos eléctricos se podría lograr, uno de los cuales determina el número y tamaño de las partículas y de los otros controles de su actividad metabólica.

conteo de partículas

El conde y la determinación del tamaño de partícula puede hacerse sobre la base de «Coulter» utilizando un contador Coulter Counter (Coulter empresa Electricidad, Luton, Reino Unido). El método se basa en hacer pasar una corriente eléctrica entre dos electrodos colocados en los lados del tabique con un pequeño agujero. Cuando las partículas o células en suspensión en el pase electrolito a través de la abertura, que desplazan un volumen de electrolito, que igual en volumen, provocando la caída de la corriente continua de conductividad, que depende del tamaño de la celda. Estos cambios en la conductancia determinados por el instrumento y se pueden convertir en una secuencia de impulsos de tensión, en el que la amplitud de cada impulso es proporcional al volumen de las partículas y el número de impulsos correspondientes al número de partículas.

Este método es ampliamente utilizado en los laboratorios de investigación para experimentos que requieren la determinación de tamaño de celda o la distribución, y el uso en microbiología clínica, se requiere la determinación de bacterias [1]. En microbiología de los alimentos, este método, sin embargo, sigue siendo poco utilizado. Hay informes para determinar el número de células en la leche [49] y definición de la levadura de la cerveza [83], pero otra información de investigación no es suficiente. Cualquier uso de conteo de partículas sería en microbiología de los alimentos, probablemente limitado no viscoso muestras o líquido líquidos, libre de partículas suspendidas, ya que una cantidad muy pequeña de muestra puede causar distorsión significativa de los resultados y la obstrucción del orificio.

actividad metabólica

En el trabajo [123] fue reportado primero en el uso de mediciones eléctricas para controlar el crecimiento de microorganismos. El autor utiliza la medición de la conductividad para controlar la descomposición de la sangre, y llegó a la conclusión de que los cambios eléctricos causados ​​iones, formados por la descomposición bacteriana de los componentes sanguíneos. Después de este primer informe usar medidas eléctricas para controlar el crecimiento de microorganismos fue estudiada por varios investigadores, y su funcionamiento es generalmente exitosa. Sin embargo, este método no es ampliamente utilizado hasta entonces, hasta que se convirtió instrumentos fiables disponibles que pueden controlar los cambios eléctricos en los cultivos microbianos.

En la actualidad, se producen cuatro dispositivos para la determinación de microorganismos usando mediciones eléctricas. Sistema Sistema de Malthus (IDG, señor Bury, Reino Unido) basado en el trabajo de [105], controla los cambios de conductividad en el medio de crecimiento, similar al sistema de Rabit sistema {Don Whitley Scientific, Yorkshire). Bactometer dispositivo (bioMérieux, de Beyzingstok, Reino Unido) y Batrac (SyLab, de Purkersdorf, Austria) [6] puede controlar tanto la conductancia y la reactancia capacitiva. Todos estos dispositivos tienen los mismos componentes básicos:

a) un sistema incubador para almacenar muestras a una temperatura constante durante el ensayo;

b) una unidad de control que mide la conductividad activa y / o la capacitancia de cada célula a intervalos regulares (usualmente cada 6 min);

c) un sistema informático de procesamiento de datos que presenta los resultados en un formato fácil de usar.

La determinación del crecimiento de microorganismos utilizando sistemas eléctricos se basa en la medición de cambios iónicos que se producen en el medio debido al metabolismo de microorganismos. Los cambios causados ​​por el metabolismo de los microorganismos, y los procesos electroquímicos utilizados en estos sistemas, se describen con algún detalle en la literatura [23, 45, 46]. El principio es que con el crecimiento y el metabolismo de las bacterias, la conductividad del medio aumenta. Los cambios eléctricos causados ​​por un pequeño número de bacterias no pueden determinarse utilizando los dispositivos producidos actualmente. Para registrar cambios, 1 ml debe contener aproximadamente microorganismos 106. Este valor se conoce como límite de detección y el tiempo necesario para llegar a este punto se denomina tiempo de detección.

Cuando se utilizan sistemas eléctricos para determinar el número de microorganismos en los productos alimenticios, primero se debe homogeneizar la muestra. La muestra homogeneizada se coloca en una célula o tubo de ensayo que contiene un medio de crecimiento y se conecta a él con una unidad de control de la cámara de incubación o termostato. Las propiedades eléctricas del medio de crecimiento se registran durante el período de incubación. Un recipiente de muestra suele ser un tubo de ensayo de vidrio o plástico o una celda en la que se colocan dos electrodos. El tubo se llena con un medio adecuado para el cultivo de los microorganismos y se añade una muestra homogeneizada del producto alimenticio. Los cambios eléctricos que ocurren en el medio de crecimiento durante el metabolismo de los microorganismos son monitoreados por electrodos y registrados por el instrumento.

Con el crecimiento y durante el metabolismo de los microorganismos, se forman nuevas sustancias en el medio. Normalmente, los substratos sin cargas o cargas débiles se convierten en productos finales altamente cargados [44], aumentando la conductividad activa del medio. El crecimiento de algunos microorganismos (por ejemplo, levadura) no conduce a un aumento significativo de la conductividad, lo que se debe probablemente al hecho de que estos microorganismos no producen metabolitos ionizados, y esto puede conducir a una reducción de la conducción en el crecimiento.

Cuando se utiliza un medidor de impedancia, la resistencia eléctrica del medio de crecimiento se registra automáticamente durante el período de incubación a intervalos regulares (por ejemplo, a través de 6 min). Cuando se detecta un cambio en el parámetro eléctrico supervisado, el tiempo transcurrido desde el comienzo de la prueba es calculado por el ordenador y normalmente se visualiza como el tiempo de detección. La curva total de los cambios en el parámetro eléctrico a lo largo del tiempo (véase la figura 8.1) es similar a la curva de crecimiento bacteriano, que tiene una forma sigmoidal con tres secciones:

a) región inactiva, donde todos los cambios eléctricos están por debajo del umbral de detección del dispositivo;

b) una región activa donde se producen cambios eléctricos rápidos y

c) una región estacionaria o una región de decaimiento situada inmediatamente después de la región activa e indicando una desaceleración de los cambios eléctricos.

No considere la curva de respuesta eléctrica como una similitud con la curva de crecimiento de microorganismos. Se considera [45] que la fase logarítmica y la fase logarítmica del crecimiento del microorganismo caen sobre las regiones inactivas y activas de la curva de respuesta eléctrica, al umbral de detección del dispositivo y más allá. Las fases logarítmicas y estacionarias del crecimiento bacteriano corresponden a la región activa ya la región de disminución de las curvas de respuesta eléctrica.

Cuando se utilizan los datos de tiempo de detección obtenidos con instrumentos eléctricos, se debe realizar una calibración para evaluar la calidad microbiológica de la muestra del producto. La calibración consiste en probar muestras usando una prueba de placa tradicional y una prueba eléctrica. Los resultados se representan gráficamente, con el resultado tradicional en el eje y y el tiempo de detección en el eje x (véase la figura 8.2). El resultado es una curva negativa cLa curva de conductividad activa, obtenida con el crecimiento de bacterias en un entorno favorable

La fig. 8.1. La curva de conductividad activa, obtenida con el crecimiento de bacterias en un entorno favorableCurva de calibración que muestra los cambios en el tiempo de detección de la conductividad y el número total de microorganismos viables

La fig. 8.2. Curva de calibración que muestra los cambios en el tiempo de detección de la conductividad y el número total de microorganismos viables

datos que abarcan 4-5 ciclos logarítmicos de microorganismos con un coeficiente de correlación mayor que 0,85 [45]. Las calibraciones deben realizarse para cada tipo de muestra probada por métodos eléctricos; diferentes muestras contendrán diferentes tipos de microflora con diferentes tasas de crecimiento. Si la calibración no se realiza correctamente, esto puede afectar significativamente el tiempo de detección y conducir a resultados incorrectos.

Hasta ahora, hemos considerado el uso de instrumentos eléctricos para estimar el número total de microorganismos. Estos sistemas, sin embargo, se basan en el uso de medios de crecimiento y por lo tanto permiten el uso de medios especialmente seleccionados para desarrollar métodos para estimar el número o la detección de ciertos microorganismos o sus grupos. Hay suficientes trabajos dedicados a mediciones eléctricas para detectar / determinar el número de microorganismos específicos. Por ejemplo, Enterobacteriaceae se dedican [34,95], Pseudomonas - [7], Yersinia enterocolitica - [132], levadura - [31], E. coli - [42], un Campylobacter - [24].

En el futuro, el número de especies de microorganismos detectables, sin duda, aumentará. En la actualidad, un gran volumen de estudios se realizan en medios para la determinación de Listeria, después de lo cual los medios de comunicación para otros microorganismos comenzará a aparecer.

La mayoría de los métodos eclécticos descritos anteriormente se basan en el uso de una medición de contacto, es decir, los cambios eléctricos se controlan mediante electrodos sumergidos en un medio de cultivo. Algunos autores [93] señalaron el potencial de conductometría sin contacto para determinar microorganismos. En este caso, el medio de crecimiento está situado en un compartimiento de la célula, y el electrodo en el otro. El líquido que rodea el electrodo absorbe gas (por ejemplo, para dióxido de carbono es hidróxido de potasio). En el medio de cultivo se coloca

muestra, y con el crecimiento de microorganismos, se libera gas. Este gas es absorbido por el líquido que rodea al electrodo, lo que provoca un cambio en la conductividad que puede ser detectado.

Este método permite resolver el problema de los microorganismos causando sólo un pequeño cambio en la conductividad en las células tradicionales para la conductometría de contacto. Tales microorganismos (por ejemplo, muchos tipos de levadura) son muy difíciles de detectar por métodos tradicionales de conductometría directa, pero cuando se usa un control conductométrico sin contacto, la definición se hace bastante simple [10]. El desarrollo de métodos indirectos en el futuro podría mejorar significativamente la capacidad de los sistemas eléctricos para detectar microorganismos que causan pequeños cambios eléctricos en los sistemas de contacto, promoviendo la aplicación de este método en la industria alimentaria.

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